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一、摘要
免疫治疗的兴起彻底改变了晚期黑色素瘤的治疗方法,极大的延长了晚期黑色素瘤患者的生存时间。尽管如此,大多数晚期黑色素瘤患者仍然死于该疾病,这主要是由于先天性或获得性免疫治疗抗性所致。不幸的是,对于免疫疗法的抗性机制,目前仍然知之甚少。本文作者通过对77例接受抗PD-1和抗CTLA-4治疗的晚期皮肤黑色素瘤患者的全基因组数据、转录组数据和甲基化数据进行综合分析,探究了可能的耐药机制并评估了新的生物标志物,在黑色素瘤免疫治疗耐药性方面,提出了新的见解。
二、流程图
三、结果简述
1.77例晚期黑色素瘤患者的临床特征
如下图所示,作者收集了77例抗PD-1免疫治疗的晚期皮肤黑色素瘤组织样本,其中包括单独PD-1和PD-1联合IPI两种治疗方式。从活检到免疫治疗开始的中位时间为5.2个月,肿瘤组织主要来自皮下和区域淋巴结。在77例患者中有66例患者的肿瘤发生于非肢端皮肤部位,11例为隐匿性原发性黑色素瘤,患者年龄的中位数为58,其中有51例为男性患者。
2.高肿瘤突变负荷,低结构变异负荷和高新抗原负荷预示更好的免疫反应
首先,作者探索了每个样本的SNV,SV和CNA与免疫治疗反应的关系(下图A)。如图B-D所示,高TMB预示着更好的免疫应答,高SV和高CNA预示着更差的免疫应答。当根据免疫治疗类型进行分类时,PD-1治疗反应与TMB显著相关而IPI+PD-1治疗反应与SV显著相关。高TMB和低SV与免疫治疗后患者的PFS改善显著相关。此外,作者还观察到TMB与新抗原负荷存在很强的相关性(r=0.92,p<0.0001)且高新抗原负荷预示更好的免疫应答(图E-F)。
3.免疫治疗反应和免疫抗性与基因突变无关
接着,作者探索了免疫治疗反应与特定的基因突变的关系。如上图A所示,TCGA分子亚型与免疫治疗反应无关(p=0.24)。为了寻找可能与治疗反应相关的其他突变基因,作者对SNV和小插入缺失进行了全基因组分析,但未发现具有显著意义的基因。同时,作者收集了以往研究中与免疫反应相关的基因,结果表明,它们的突变状态与免疫应答也无显著相关性。
4.干扰素和T细胞受体信号通路在免疫治疗反应组中富集
作者对77个黑素瘤中的53个患者进行RNAseq测序,接着对有无免疫应答的患者进行差异分析,得到205个DEGs,其中一些上调基因先前已被证明与免疫治疗反应相关(CD274,STAT1,IFNG,GZMA,PRF1,GZMB,CD8A等),富集分析结果表明,IFNγ反应通路在免疫应答患者中显著富集(下图A)。
随后,作者对43个样本进行甲基化测序,可能是由于样本量小和肿瘤起源组织的变异性的原因,差异分析仅鉴定到5个差异甲基化CpG位点且这些位点都不在基因启动子中。因此作者重点关注了205个DEGs的甲基化水平。结果显示,有5647个CpG位点被定位到192个DEGs中,173个基因中的1671个CpG位点与表达显着相关。127个基因中的568个探针被定位到启动子区域并与表达负相关,41个基因具有5个或更多个与表达负相关的CpG位点。其中,PSMB8的CpG位点甲基化与表达负相关,且在免疫应答和非应答患者中存在显著差异。
接着,作者分析了与免疫应答相关的基因集的表达水平。如下图B所示,许多基因的表达在免疫应答组和无应答组中存在显著差异,同时,6-基因IFNγ(图C),18-基因IFNγ(图D),效应T细胞(图E),IFNγ/效应T细胞(图F),趋化因子(图G)和TIDE(图H)等基因集的表达在两组中差异显著。
5.黑色素瘤患者的免疫景观
接着,作者通过CIBERSORT计算出免疫细胞浸润丰度,并绘制相应的免疫景观图(下图A)。如下图B-C所示,免疫应答组中M1巨噬细胞和CD8T细胞浸润水平较高,methylCibersort结果与之一致(下图D)。基于PRF1和GZMA的表达水平评估细胞溶解活性,结果显示细胞溶解活性在CD8T细胞激活时上调,在免疫应答组同样上调(下图E)。PRF1和GZMA的低甲基化与高免疫应答有关(下图F)。免疫组化分析表明CD8T细胞与更好的免疫应答相关(下图G),瘤内CD8T细胞表达增加(下图H)。此外,PD-L1表达水平在免疫应答组中更高(下图J)。
6.TMB和IFNg-6评分可以独立预测免疫治疗反应
由于TMB,IFNg-6和CD8+T细胞都与应答有关,作者接下来探究了TMB与IFNγ-6和CD8T细胞的相关性,结果显示,TMB与IFNg-6(r=0.1839,p>0.05)和CD8+T细胞(r=0.114,p>0.05)无关,表明它们是独立的预测因素。
为了进一步验证上面的结论,作者使用53例样本构建了预测免疫治疗反应的回归模型。首先,对TMB,SV,肿瘤纯度等特征进行单因素回归分析,进一步对有意义的特征进行多因素回归分析并构建模型。结果显示,TMB结合IFNγ在所有模型中表现最好(下图A),高TMB和高IFNg-6的肿瘤显示出对免疫疗法的最佳反应并且预示着更长的PFS(下图B)和更长的OS(下图C),以上结论在验证集中均得到验证(下图D,下下图A,B)。
7.与TMB/IFNγ-6模型预测结果不一致的样本剖析
接着,作者对TMB/IFNg-6双变量模型未正确预测结果的12名患者进行了临床和分子检查,以深入了解其潜在的特异性耐药机制。如图C所示,7例接受了PD1治疗的样本与可以准确预测的患者没有相同的分子特征,第8例样本具有潜在的耐药生物学机制(即JAK3突变),在8个样本中,4例样本高TMB,低IFNγ-6, 4例样本的TMB低,IFNγ-6高。
五、总结
在本文中,作者通过对收集的77例黑色素瘤患者的转录组数据,全基因组数据和DNA甲基化数据进行多角度的分析,筛选出了免疫治疗应答的生物标志物,同时结合TMB和IFNγ-6构建并验证了一个稳定的免疫治疗反应预测模型。多组学的综合分析以及内部数据稳定支撑是本文的亮点,也是本文发到30+很重要的因素。整体而言,文章中所涉及的分析难度并不大,如果各位小伙伴手里也有优质数据但不知道怎么用的话,这篇文章有着很高的参考价值~
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责任编辑:
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