季节性饮食变化改变活蝙蝠的肠道微生物群：适应能量收获和营养利用的意义

导读  

微生物群落组成和功能的可塑性可以使宿主适应生态、环境和生理变化。迄今为止，关于肠道微生物-宿主关系的大部分信息来自实验室模型生物的研究，而关于野生动物及其与肠道微生物的生态相关性的信息却知之甚少。目前还不清楚微生物群落组成和活动如何适应由无脊椎动物向脊椎动物饮食扩展所引起的饮食和能量、营养需求和利用的变化。南蝠（Ia io）既是食虫动物又是活体动物（即食禽动物），为研究其饮食-宿主-微生物群-生理学关系提供了契机。该研究通过16S rRNA扩增子测序和I. io成年男性功能预测研究了这种关系。研究发现，肠道微生物多样性相似，而微生物群落结构在食虫动物和食禽动物之间存在显著差异。此外，厚壁菌门的相对丰度和厚壁菌门/拟杆菌门比值的增加、碳水化合物和核苷酸代谢的改变以及假单胞菌的减少与狩猎鸟类能量需求的增加以及进入冬眠和迁徙的脂肪储存有关。这些发现表明，季节性饮食变化会导致肠道微生物的组成和功能发生显著变化，从而促进蝙蝠适应具有挑战性的鸟类饮食生态位。结果表明，肠道微生物群落可以不断地对饮食的变化做出反应，潜在地促进野生动物饮食生态位的多样性，增强我们对饮食-宿主-微生物-生理关系的理解。

论文ID原名：Seasonal Dietary Shifts Alter the Gut Microbiota of Avivorous Bats: Implication for Adaptation to Energy Harvest and Nutritional Utilization

译名：季节性饮食变化改变活蝙蝠的肠道微生物群：适应能量收获和营养利用的意义

期刊：mSphere

IF：4.389

发表时间：2021.8.4

通讯作者：冯江、江廷磊

通讯作者单位：东北师范大学吉林省动物资源保护与利用重点实验室；东北师范大学草地科学研究所植被生态学教育部重点实验室

DOI号：10.1128/msphere.00467-21

实验设计

结果

经过质控，测序工作共获得929,674个读长，平均为29,052±标准差（SD）， 每个样本6,289个序列（最小20,316；最大55,341；见补充材料表S1），共有4,671个ASVs。将非细菌、叶绿体和线粒体ASVs排除并稀释后，使用剩余的4,522个ASVs进行分析。此外，前臂长度没有显著差异（Z = -1.602，P = 0.109），而食虫动物和食禽动物之间I. io的质量（Z = -4.560，P < 0.001）存在显著差异（见图2A和表S1）。 

1. Alpha和beta多样性

食虫动物和食禽动物中I. io的四项肠道微生物多样性指标无差异（P > 0.05；图1和表1）。此外，体重对微生物多样性没有影响（P > 0.05；表2）。食虫动物和食禽动物中的β多样性存在显著差异（图2B-D）。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析（PCoA）（置换多变量方差分析[PERMANOVA]：R2 = 0.0758，P = 0.001；图2B）、基于未加权的UniFrac距离（PERMANOVA：R2 = 0.0743，P = 0.004；图2C）以及基于加权的UniFrac距离（PERMANOVA：R2 = 0.0808，P = 0.014；图2D）清楚地显示了肠道微生物群落由饮食聚集。同时，多元分散置换分析（PERMDISP）表明，Bray-Curtis距离（F = 3.574，P = 0.078；图S1A）、未加权UniFrac距离（F = 1.085，P = 0.318；图S1B）和加权UniFrac距离（F = 2.683，P = 0.099；图S1C）均呈现均匀分散。

图1. 食虫动物和食禽动物之间南蝠肠道微生物群落α多样性指数。（A）观察到的ASVs；（B）Shannon多样性指数；（C）均匀度；（D）Faith系统发育多样性。各α多样性指数均无显著差异；P＞0.05（表1和表2）。  图2. （A）南蝠的体重和前臂长度在食虫动物和食禽动物之间的差异；***， P ＜0.001；NS，无显著差异（B-D）夜间蝙蝠肠道微生物群落结构的主坐标分析（PCoA）图；（B）基于Bray-Curtis距离；（C）基于未加权的UniFrac距离；（D）基于加权的UniFrac距离。表1. 南蝠肠道微生物群落α多样性指数在食虫动物和食禽动物中的差异。表2. 体重和微生物（α）多样性之间的简单线性回归。2. 肠道菌群组成及变化

分类划分明确表明，优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），它们是所有蝙蝠个体的核心微生物组成分（图3A和C）。在门水平上，厚壁菌门（Firmicutes）（相对丰度在食虫动物中为44.1%，在食禽动物中为62.4%）和变形菌门（Proteobacteria）（相对丰度分别为38.3%、28.3%）在肠道菌群中占主导地位，其次是食虫动物和食禽动物中的拟杆菌门（Bacteroidetes）（相对丰度分别为4.0%、2.5%）（图3A）。我们比较了六个最常见的细菌门的相对丰度。与食虫动物相比，食禽动物中厚壁菌门（Firmicutes）显著增加（Z = -2.073，P = 0.038），脱硫菌属（Desulfobacterota）（Z = -2.573，P = 0.010）和Rs-K70_termite_group（Z = -2.656，P = 0.008）显著减少（图4A和表S2）。在属水平上，不同饮食的蝙蝠个体肠道微生物群落组成存在差异（图3B和D）。食虫动物中肠道菌群相对丰度以假单胞菌（Pseudomonas）（17.6%）为主，其次为分节丝状菌（Candidatus Arthromitus）（12.8%）和肠球菌（Enterococcus）（5.9%）。而食禽动物中肠道菌群最多的是梭状芽胞杆菌（Clostridium_sensu_stricto_1）（15.1%）、拟孢菌（Paeniclostridium）（13.9%）、志贺氏杆菌（Escherichia-Shigella）（11.3%）和肠球菌（Enterococcus）（10.6%）四个属。结果表明，与食虫动物相比，食禽动物中梭状芽胞杆菌（Clostridium_sensu_stricto_1）、拟孢菌（Paeniclostridium）和志贺氏杆菌（Escherichia-Shigella）的相对丰度较高，而假单胞菌（Pseudomonas）和分节丝状菌（Candidatus Arthromitus）的相对丰度较低（P < 0.05；图4B和表S2）。共鉴定出5个门56个属，它们在不同饮食中表现出显著的相对丰度差异（表S3）。

我们在食虫动物中鉴定出2,560个ASVs，在食禽动物中鉴定出2,170个ASVs。这些ASVs总计4,522个，其中208个是在两种饮食中共享的（图5）。此外，线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）分析表明，22个ASVs在食虫动物和食禽动物微生物组间存在显著差异（LDA分数 > 2，P < 0.05；图6A）。其中7个ASVs属于厚壁菌门；13个ASVs属于变形菌门，其余2个属于拟杆菌门和弯曲菌门。当考虑到LDA评分> 4时，ASVs对不同饲料差异的影响最大，我们发现在食禽饲料中，ASV118属于Paeniclostridium（厚壁菌门），ASV182属于Escherichia-Shigella（变形菌门），ASV2和ASV117在食虫饲料中属于假单胞菌属（变形菌门）（图6A）。此外，我们还发现食禽动物中厚壁菌门与拟杆菌门的平均相对丰度比（24.65）高于食虫动物（11.11）（图6B）。

图3. 夜蝠在食虫和食禽之间的肠道微生物群落组成。（A）所有样本中细菌门的相对丰度。（B）所有样品中细菌属的相对丰度。（C）每个样品中细菌门的相对丰度。（D）每个样品中细菌属的相对丰度。对于图C和D，每个堆叠条代表一只单独的蝙蝠。在每个组中，“Others”代表所有其他门和属的相对丰度之和。

 图4. 食虫和食禽夜蝙蝠肠道微生物群落门级和属级分类群的比较。（A）最丰富的六个细菌门的相对丰度。（B）最丰富的六个细菌属的相对丰度。柱状图显示平均数±标准误差（SE）。*，P＜0.05；**，P＜0.01；***，P＜0.001；NS，无显著差异。

 图5. 维恩图显示食虫和食禽动物中ASVs的重叠数。

 图6. （A）通过LEfSe分析确定食虫和食禽动物ASVs和LDA评分的差异。（B）夜行蝙蝠食虫和食禽组间厚壁菌门平均相对丰度与拟杆菌门平均相对丰度之比。

3. 微生物功能的变化

我们的研究结果表明，微生物的功能可分为12个代谢类别（图7）。7种预测代谢相关功能类别的相对丰度在食虫动物和食禽动物之间发生显著变化。以鸟类为食的蝙蝠个体与碳水化合物代谢（Z = -2.337，P = 0.019）和核苷酸代谢（Z = -3.053，P = 0.002）相关的微生物群相对丰度较高。然而，以昆虫为食的个体与全球和概述图相关的微生物群相对丰度较高（例如，碳和脂肪酸代谢；Z = -2.714，P = 0.007）、氨基酸代谢（Z = -2.751，P = 0.006）、外源生物降解代谢（Z = -2.035，P = 0.042）、其他次级代谢产物的生物合成（Z = -2.261，P = 0.024）、萜类和聚酮代谢（Z = -2.563，P = 0.010）（图7和表S4）。

图7. 基于食虫和食禽饮食中KEGG 2级代谢相关类别的微生物宏基因组功能预测。相对丰度代表不同代谢类别中KEGG分配的百分比。柱状图表示平均数±SE。*，P＜0.05；**，P＜0.01。

讨论

该研究发现季节性饮食变化与I. io肠道菌群多样性的变化密切相关，这支持了我们的第一个假设，即饮食变化与肠道菌群组成变化相关。此外，蝙蝠个体肠道微生物的组成和功能随禽类饮食变化，如厚壁菌门相对丰度的增加，厚壁菌门、拟杆菌门比率的增加，碳水化合物和核苷酸代谢以及假单胞菌的减少，与狩猎鸟类更高的能量需求和进入冬眠和迁徙时的脂肪储存有关，这支持了我们的第二个假设，即肠道菌群的组成和功能的变化与食物能量和营养的吸收和利用有关。这些结果表明，I. io独特的饮食、肠道菌群和生理功能之间存在不可分割的关系。研究结果有助于我们理解肠道微生物在从无脊椎动物向脊椎动物的饮食生态位扩展中的作用。

饮食的季节性变化会导致动物肠道微生物多样性的变化。例如，肠道微生物多样性的变化与贵州马铁菊头蝠 (Rhinolophus ferrumequinum) 和大熊猫饮食的季节性变化是一致的。然而，本研究中食虫动物与食禽动物的肠道微生物α多样性差异不显著，可能有以下两个原因。一方面，尽管昆虫和鸟类在大小和营养质量上存在差异，但它们的组织组成都是同质的。另一方面，以往的研究表明，秋季环境中的昆虫多样性下降。然而，我们未发表的数据表明，在秋季，蝙蝠的个体饮食多样性并没有增加，因为蝙蝠捕食的一种鸟类的体型和营养可能相当于许多昆虫。此外，一些食肉的I. io个体不仅吃鸟类，也吃一些昆虫，这并不排除昆虫仍然是肉食组的食物。这与观察到的食虫和食虫膳食中共享的一些肠道微生物（208 ASVs）的结果一致。在这些情况下，没有观察到肠道微生物多样性的差异是合理的。尽管在我们采用的任何指标（α多样性）中，I. io的肠道微生物群落多样性没有差异，但不同饮食结构之间的肠道微生物群落结构（β多样性）存在显著差异。这一发现表明，I. io可能不需要改变肠道微生物多样性来适应禽类饮食；相反，饮食的改变只需要改变肠道微生物群落的组成。由于I. io在秋季除了捕食鸟类外，还捕食昆虫作为饮食补充，这种变化可能是有益的。结果与之前对美国鼠兔（Ochotona princeps）的研究一致，表明β多样性的变化而不是α多样性的变化是为了适应苔藓的新饮食。因此，这种模式可能是野生动物适应新饮食的常见模式。然而，以往的研究表明，蝙蝠的微生物群可以反映其地理位置，包括饮食、蝙蝠居住的洞穴、水源等。未来的研究应收集环境场所的微生物群落来建立这种关联。

以往的研究表明，蝙蝠的肠道菌群以变形菌门（Proteobacteria）为主，是组成最独特的菌门，其次是厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）。而在本研究中，厚壁菌门（Firmicutes，53%）和变形菌门（Proteobacteria，33%）是I. io肠道菌群中的两个优势菌门。在其他哺乳动物，如狮子（Panthera leo）和须鲸，以及人类，厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）占主导地位。因此，我们的研究结果表明，肠道菌群的独特组成可能与禽类饮食有关。这种情况可能出现在其他食肉蝙蝠中，甚至在特定的食肉蝙蝠中，但还需要进一步的研究。

通过对不同饮食条件下肠道微生物组成的比较，发现I. io肠道某些主要菌门和属的相对丰度存在显著差异。在门水平上，食禽下厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度显著高于食虫下厚壁菌门（Firmicutes）的相对丰度。厚壁菌门（Firmicutes）可以产生大量与消化效率相关的能量丰富的短链脂肪酸，这可能对需要从饮食中最大限度地获取能量的动物至关重要。与无脊椎昆虫相比，候鸟具有较高的营养价值和能量价值。因此，我们可以假设，厚壁菌门（Firmicutes）的增加可以满足食性蝙蝠个体对养分吸收和能量提取的需求。厚壁菌门（Firmicutes）还负责一些关键的代谢转化，并在人体肠道菌群中多糖降解产生能量方面发挥重要作用。此外，厚壁菌门与拟杆菌门比率的变化与脂肪沉积和潜在的肥胖有关，这一证据来自模型系统和人类。例如，相对于瘦老鼠，肥胖老鼠的厚壁菌门（Firmicutes）与拟杆菌门的比例明显更高。在人类中，肥胖者（如西欧儿童）往往比瘦人（如非洲农村儿童）具有更高的厚壁菌门与拟杆菌门比率。在我们的研究中，食禽个体中厚壁菌门与拟杆菌门的平均比率是食虫个体的两倍以上。因此，在I. io的秋季，较高的厚壁菌门与拟杆菌门的比例可能会促进鸟类更有效地从饮食中储存和/或提取能量，最终导致蝙蝠进入冬眠和迁移之前体内总脂肪的增加。

在属和ASV水平上，变化显著的细菌几乎都属于厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），这可能表明它们对昆虫和鸟类膳食营养成分和能量的不同程度的适应。例如，大多数假单胞菌都能分泌胞外脂肪酶，它能分解利用底物中的脂肪产生脂肪酸、甘油、醛类、酮类等物质。与食虫个体相比，食虫个体中假单胞菌的相对丰度显著降低。这一结果也可能与I. io进入冬眠和迁移前的脂肪储存有关，假单胞菌减少，产生的脂肪酶更少，分解的脂肪更少，从而沉积了更多的脂肪。此外，由于梭状芽胞杆菌（Clostridium_sensu_stricto_1）和大肠杆菌（Escherichia-Shigella）在动物蛋白质饲料的氨基酸利用中发挥着重要作用，因此，食鸟蝙蝠个体中两种细菌属的显著增加可能在蛋白质利用中发挥作用。鸟类的蛋白质质量比昆虫高，含有大量的氨基酸。正如预期的那样，以鸟类为食的蝙蝠个体的体重比以昆虫为食的蝙蝠个体的体重大，而前臂长度则没有。这些结果进一步证实了肠道微生物主要菌门和属的变化对能量的获取和营养的利用。因此，我们的研究结果表明，肠道微生物的变化可以促进对觅食行为和生活史特征（即冬眠和迁移）变化的能量和营养需求的适应。

从昆虫向鸟类饮食的转变不仅改变了肠道微生物的组成，而且影响了肠道微生物的功能。我们发现蝙蝠捕食鸟类丰富了与碳水化合物和核苷酸代谢相关的功能类别。这可能与蝙蝠在捕食飞行中的鸟类时消耗更多、更快的能量有关，因为蝙蝠可能需要飞得更远、更高、更快，以捕食夜间迁徙速度高的鸟类。因此，增加碳水化合物和核苷酸代谢所提供的更多能量可能满足了狩猎鸟类的能量需求。这些结果表明，在蝙蝠捕食鸟类的过程中，与特定代谢相关功能相关的肠道微生物群发挥着至关重要的作用，同时也在获取能量。然而，PICRUSt2是一种用于分析微生物群落功能的预测工具，它有两个主要的局限性——罕见的环境特异性功能不太可能被识别出来，这些功能不能提供分辨菌株特异性功能的分辨率。因此，在进一步的研究中，需要宏基因组测序来揭示与肠道微生物类群相关的功能变化对饮食变化的响应。

综上所述，我们的研究结果表明，季节性饮食的变化驱动了肠道微生物群落的组成和功能的显著和具体的变化，促进了蝙蝠对一种独特的鸟类饮食诱导的能量和营养吸收和利用的适应。据我们所知，这是第一项研究肠道微生物群和饮食之间的关系，从无脊椎昆虫（祖先的饮食）进化到小型脊椎动物，如鸟类。这些结果表明，由饮食变化引起的肠道微生物群的变化，或者可能是由所消费的食物暂时引入的不同微生物群引起的肠道微生物群的变化，使野生动物的饮食生态位从无脊椎动物扩大到脊椎动物的食物资源，从而减少种间竞争，增强适应度。研究结果也为肠道细菌在野生哺乳动物中产生生态多样性和灵活性的作用提供了新的见解。本研究的一个局限性是PICRUSt2预测了与食禽相关的微生物群落功能。需要用宏基因组测序进一步的操作实验来解开复杂的宿主-微生物-生理关系，最终目的是检测因果关系。进一步的研究需要通过圈养的蝙蝠群体进行生理学实验，以评估吃不同食物（昆虫和鸟肉）的个体之间的代谢差异，更好地将微生物群的变化与蛋白质分解代谢或其他结果联系起来，而不仅仅是体重。

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