《Cancer Cell》：生信分析与CRISPR基因编辑技术的巧妙结合（IF=31.7）

发布时间：2024-11-26 20:16

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随着2020年诺贝尔化学奖的揭晓，基因组编辑——这一改写生命密码的工具，成为了当前炙手可热的研究热点。笔者将从生物信息学的角度，与大家共同探讨利用CRISPR/Cas9技术对过继免疫疗法靶点的筛选与鉴定。

---写在前面---

基础知识：

1. 何为CRISPR/Cas9基因编辑技术？

简单来讲，CRISPR-Cas9是一种分子生物学技术，通过这种技术科研人员可以对细胞和生物体内的基因进行编辑。即对生物体内的遗传物质进行修改。

CRISPR-Cas9技术包含两种重要的成分，一种是行使DNA双链切割功能的Cas9蛋白，而另一种则是具有导向功能的sgRNA（single guide RNA）。当细胞内同时表达sgRNA和Cas9蛋白时，Cas9蛋白通过与sgRNA结合，靶向到目的DNA序列上发挥DNA双链切割的功能。DNA序列被切割产生断裂后，引发细胞内部的DNA修复机制。真核细胞同时存在着同源重组修复和非同源重组修复。在同源重组修复下，断裂的染色体以另一条完整的姐妹染色单体为模板进行DNA修复，而在非同源重组修复下，断裂出的DNA随机修复，引入新的碱基，使基因产生移码突变。

2. 何为过继免疫疗法？

过继免疫疗法( adoptive immunotherapy, AIT)是把致敏淋巴细胞（具有特异免疫力的）或其产物在体外激活并扩增，再回输给细胞免疫功能低下者（如恶性肿瘤患者），使其获得抗肿瘤免疫力。过继免疫或继承性免疫犹如继承他人的财产而获得财力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法，属于肿瘤生物疗法中的一种。目前常用于过继免疫治疗的免疫细胞有NK细胞、LAK细胞、TIL细胞和CTL细胞。

一、摘要

1.研究背景

①T细胞是目前所有有效的癌症免疫疗法的核心，但定义治疗效果的抗肿瘤T细胞的特征还没有被全面阐明。

②使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)和基因修饰的T细胞的过继T细胞转移免疫疗法（ACT）可以诱导转移性人类恶性肿瘤的完全和持久的消退。

2.研究方法

①CRISPR文库筛选，将不同基因的sgRNA（与DNA互补的向导RNA）转入特定细胞，实现目的基因敲除。

②根据需要进行表型筛选、测序，挖掘与表型相关基因。

③利用CRISPR构建包含25个激酶的文库：其中每个激酶设计3条sgRNA，4个表型分为4组。选取无靶向（阴性对照）和阳性对照的sgRNA加入库中进行CRISPR文库筛选。

3.结论

p38激酶是所有四种表型的中心调节因子，p38的药理抑制提高了小鼠抗肿瘤T细胞的效能，增强了人类肿瘤反应性T细胞和基因工程T细胞的功能。

二、流程图

三、结果简述

1.多表型CRISPR-Cas9遗传筛选的表型选择和验证

由于T细胞是免疫治疗的核心，因此作者首先在过继性T细胞转移免疫疗法的T细胞培养过程中，用CRISPR-Cas9的原代T细胞遗传筛选，同时利用荧光激活细胞分选术筛选敲除后能提高T细胞杀伤肿瘤能力的细胞，即TCR激活的小鼠CD8+T细胞。

为了鉴定和验证用于多表型CRISPR-Cas9小鼠原代T细胞筛查的有效抗肿瘤T细胞的质量，作者使用以下选择标准从已发表的文献中确定了表型：在临床前或临床研究中，具有代表性的标记物必须与T细胞功能障碍有关；标记物必须是可用高通量单细胞分析来测量的，以确保适应性、可扩展性和重复性。最初选择了三种表型，即细胞扩增、记忆样(干性)和代谢适合性，根据它们与ACT临床疗效的相关性进行筛查(图A)。细胞计数作为表型读数。考虑到已报道的ACT输液产品中T细胞数量增加与治疗效果之间的临床关联，细胞扩增是相关的。以L-选择素(CD62L)表达为特征的干细胞样记忆表型被选为第二表型。B图中，基于荧光激活细胞分选(FACS)的不同亚群小鼠CD8+T细胞总ROS水平的定量。

而后用流式细胞仪对20天后从皮下植入B16黑色素瘤的PMEL-Thy1.1宿主动物的脾脏和肿瘤中分离的T细胞中的总细胞ROS进行定量（C图）。从移植了B16黑色素瘤的PMEL-Thy1.1宿主第20天的脾脏和肿瘤中分离出T细胞。检测过继转移和rVV hgp100攻击后CD8+T细胞gH2AX水平。

2.多表型CRISPR-Cas9基因筛查确定p38激酶是T细胞所需表型的调节因子

利用CRISPR构建包含25个激酶的使用文库：其中每个激酶设计3条sgRNA，4个表型分为4组，每组设置2个重复。选取阴性对照（无靶向）和阳性对照的sgRNA加入库中进行CRISPR文库筛选。将sgRNA转入特定细胞后，需要对CRISPR文库筛选表型。于是作者利用流式细胞仪对细胞增长、细胞干性、氧化压力（ROS）等标志性表型细胞进行筛选，结果显示分选表型为细胞增长加快、CD62L上调，ROS和γH2AX下调的T细胞。

表型确定后，作者另辟蹊径通过测序及生信分析对这四种表型进行分析，首先根据表型将测序结果分别排序；接着使用“基因多效性评分”方法进行打分；同时重复取交集、sgRNA标准等方法最终获得排名最高的激酶Mapk14（p38）。

3.p38激酶作为小鼠T细胞扩增表型靶点的遗传学和药理学验证（基因敲除实验）

由于表型确定后可以通过测序及分析能够挖掘得到p38基因，若敲除p38基因，是否可以得到一致的表型呢？于是作者进行了表型验证，同样通过sgRNA转染细胞敲除p38基因来验证4种表型变化，结果显示新sgRNA能有效敲除p38基因且4种表型变化与预期一致。

4.p38激酶体内外实验的生物学验证

接下来，作者分别在体外和体内对表型对应的生物学功能进行了验证。

① 体外验证：p38激酶通过不同的转录和代谢改变驱动氧化和基因组应激

作者用p38抑制剂（p38i）对细胞内ROS水平以及代谢物水平的谷胱甘肽、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶等表达量进行验证，同时转染到T细胞进行转录测序分析，发现p38i可以下调ROS通路，更为关键是转录组分析显示与之前4种表型完全吻合。

②体内验证：p38抑制增强人外周血单核细胞(PBMC)和TIL过继转移所需的特性

作者用p38i培养黑色素瘤患者的肿瘤浸润淋巴细胞，结果显示T细胞增长加速、CD62L+细胞数量明显增多；同时作者利用基因工程培养T细胞，转染后发现效率不变，同时明显保留了CD62L+/CD8+/CTR+T细胞。

5.药物抑制p38信号促进针对实体和血液系统恶性肿瘤的T细胞的记忆特征和细胞毒能力

接下来，作者研究了抑制p38是否有利于临床方案中使用的工程化人类T细胞培养。

此外，为了研究p38i是否有利于CAR修饰的PBMC的转导和扩增，本文分别在存在和不存在p38i的情况下，利用第二代临床CD19-CAR结构(aCD19-CAR)对人类T细胞进行了基因工程(图A为示意图)。特别是，p38i转导和扩增的aCD19-CAR T细胞显著增强了肿瘤特异性细胞溶解(图K)。这些结果确立了在体外T细胞培养过程中抑制p38信号以改善ACT的相关性和临床可行性。

6.抑制p38提高TCR和CAR过继免疫治疗中T细胞的抗肿瘤效果

将p38i体外培养的T细胞重新回输进小鼠体内后，显示预后效果较好，瘤体缩小且小鼠生存期显著增加。结果表明：p38i体外培养T细胞杀伤肿瘤的能力显著增强（与临床紧密联系）。

四、总结

在本文中，作者发现抑制p38不仅促进了T细胞的增殖，而且在调节全局T细胞抗氧化代谢中起着中心作用。此外，文中描述的p38的生物学作用最终很可能是在DNA损伤中发挥的。多表型的CRISPR-Cas9筛选可以扩展到外显性和非编码遗传元件的功能操作，其中可以识别特定细胞中复杂的通路和信号的调节。

---写在后面---

文章从基因的鉴定和筛选到表型和功能的验证，思路清晰，论证严谨，实验设计完整，辅助生信分析的基因表型分型，另有CRISPR技术的加持，成就了此篇顶刊文章。

PS：在我们的科研日记中，小伙伴可观察到，无论高分顶刊抑或低分文章，生物信息学分析已经“润物细无声”般的渗入到科研工作者和主编们的科研思维中，相信未来论文的版图中生物信息学也将成为别样的“宏观实验验证法”，亦是不可或缺的存在。愿与诸君共话成长~

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