胆碱代谢物氧化三甲胺与高血压的关系及其调控内脏脂肪组织在脂代谢作用的机制研究

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胆碱代谢物氧化三甲胺与高血压的关系及其调控内脏脂肪组织在脂代谢作用的机制研究

【摘要】： 研究背景:高血压是目前最常见的心血管疾病之一,同时也是动脉粥样硬化以及心脑血管疾病导致死亡的主要危险因素。流行病学研究结果表明,不健康的饮食和生活方式会导致人体血压调节异常,主要表现为血压升高。而人体处于高血压状态下会导致血管壁结构重塑以及功能异常,包括内皮功能紊乱以及血管硬化。肠道微生物代谢在心脏代谢稳态中的重要性日益突出。日常饮食中的鱼类、鸡蛋、谷物、乳制品以及肉类制品中含有大量胆碱,而这些膳食胆碱会经由肠源性菌群的裂解酶转化为三甲胺,后者再经过肝脏代谢后会产生氧化三甲胺(Trimethylamine oxide,TMAO)。众多研究表明TMAO这一胆碱代谢物与心血管疾病发生密切相关,其为心血管疾病的预防和治疗提供了新机遇。然而,由于TMAO的代谢与排泄速度较快,不同个体间差异巨大,并且不同种类胆碱来源的食物并不影响空腹血浆TMAO的浓度。因此,TMAO或许并不适合作为瞬时生物标志物。单一评价某一时刻TMAO的体液水平其生物学意义或许并不全面。再者,有少数研究指出TMAO对机体的心血管以及代谢可能存在有益作用。因此,TMAO在心脏代谢性疾病中的临床意义以及其致病机制均需要进一步评估。目前有关TMAO对心血管的致病机制主要包括血小板反应性增高,心肌细胞中脂肪酸的β-氧化水平降低,胆固醇和甾醇代谢的紊乱,以及血管壁炎症反应的加剧同时增加活性氧的产生。然而,有部分研究指出心血管疾病中血浆TMAO水平的升高可能类似于血浆B型钠尿肽水平升高的情况,后者既是心血管危险标记物,也是对压力/容量超负荷心脏产生有利影响的代偿反应。但是,目前依然缺乏较为系统以及全面的关于TMAO对高血压机体调控作用的研究。本研究是结合临床人群数据与细胞动物实验的综合性研究,首先利用大规模人群营养调查数据探索TMAO的主要前体营养物胆碱的总摄入量与高血压以及血压值的关系,并利用自发性高血压大鼠模型验证不同剂量TMAO的长期干预对自发性高血压大鼠血压以及心血管系统的影响;然后,结合主动脉转录组学探索TMAO对血压调控以及血管病变相关的潜在机制;同时,进一步通过观察内脏脂肪代谢状态并结合脂肪酸代谢组学揭示TMAO对高血压大鼠脂肪代谢的调控作用;最后结合内脏脂肪组织转录组学以及细胞模型揭示TMAO对高血压大鼠脂肪代谢调控的潜在分子机制。从而加深对TMAO与高血压机体之间复杂调控网络的认识,为阐明TMAO对高血压机体心血管以及脂肪代谢调控作用的潜在机制提供新的证据。第一章TMAO肠道代谢前体营养物胆碱的摄入量与高血压疾病的相关性目的:在人群中探索TMAO前体营养物胆碱的总摄入量与高血压疾病的相关性。排除正在接受高血压治疗的人群后,进一步探索胆碱总摄入量与收缩压和舒张压的相关性。为研究胆碱肠道代谢产物TMAO对高血压发病以及血压调控的作用提供临床证据。方法:1.采用R软件并利用逻辑回归模型对2007年至2018年美国国家健康与营养调查的25890名参与者进行统计分析,依据五分位数(Quantile,Q)把总胆碱摄入量分为五个水平(从低至高依次为Q1至Q5),探索高血压与总胆碱(Total choline,TC)摄入量的相关性。2.排除正在接受抗高血压药物治疗的人群后,利用多元线性回归模型分析余下的17296名参与者的收缩压(systolic blood pressure,SBP)和舒张压(diastolic blood pressure,DBP)与TC摄入量的相关性。3.利用亚组分析探讨TC与血压的关系是否随年龄、性别、身体质量指数(body mass index,BMI)、肾小球滤过率(estimated glomerular filtration rate,e GFR)以及有无吸烟而改变并检验其交互作用。结果:1.在未经调整任何协变量的回归模型I中,高血压的比值比(odds ratios,ORs)与TC水平的上限范围(Q3、Q4和Q5)呈显著负相关(P<0.001),尤其是在Q5范围内(OR:0.81,95%CI:0.75,0.87,P<0.001)。在模型II中,当对年龄、种族以及性别等协变量进行调整后,只有Q3范围的TC水平与高血压呈负相关(OR:0.90,95%CI:0.82,0.99,P=0.033)。而加入更多协变量调整模型(模型III)后,TC水平与高血压不存在显著相关的联系。2.TC摄入量与血压值的线性回归多变量调整分析显示,TC摄入量与SBP呈负相关,TC与DBP没有相关性。在回归模型I中,可以发现TC摄入量与DBP呈正相关。当TC-DBP关联模型对年龄、性别和种族进行调整后(模型II),在TC的Q4和Q5范围内可发现TC摄入与DBP呈正相关(Q4,β=0.575,SE=0.28,P=0.0401;Q5,β=0.62,SE=0.287,P=0.031)。而TC则与SBP呈负相关关系。在模型III中,当对所有协变量进行调整后,TC与DBP之间不存在显著相关的联系,而TC与SBP依旧呈显著负相关,特别在Q4和Q5范围内(β=-1.084,SE=0.429,P=0.012;β=-1.308,SE=0.59,P=0.027)。此外,还发现随着TC水平的提高,其与收缩压关联的负向趋势也在增加(P=0.014)。在不排除抗高血压治疗参与者的分析中,TC与收缩压线性回归分析结果同样显示,在模型II以及III中每一个五分位数组的TC都与SBP呈负相关,并且随着TC水平的提高,负向趋势也在增加(P=0.016和P=0.004)。3.在TC水平与收缩压的关系中,与年龄、BMI和e GFR存在显著的交互作用(P值分别为<0.001,=0.015和,<0.001)。在年龄≥60岁的人群中,较高的总胆碱摄入量更倾向于与较低的SBP相关。在BMI<25 kg/m~2和e GFR<90 mg/min/1.73m~2的参与者中,总胆碱摄入量与SBP的负向关联更强。结论:1.通过2007年至2018年美国国家健康与营养调查的大规模人群数据证实了TC摄入量与高血压之间没有显著的相关性。提示高TC摄入可能并不是高血压发病的危险因素。这将为研究其肠道代谢产物TMAO与高血压的关系提供重要证据。2.高水平TC摄入量与SBP呈显著负相关关系,受年龄、BMI和e GFR等因素影响。提示胆碱及其代谢物可能有助于降低SBP。这将为研究TMAO对血压调控的作用机制提供重要提示与证据。第二章TMAO对自发性高血压大鼠心血管系统的影响目的:探讨长期补充不同水平TMAO对自发性高血压大鼠心血管系统的影响,以加深了解其对高血压疾病发生发展的作用,为阐明TMAO对血压调节以及血管病变的作用与潜在机制提供实验证据。方法:1.给予含有333mg/L或1g/L TMAO的饮用水以及普通饲料喂养自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rat,SHR),持续22周。分组:正常饲养的维斯塔-京都(Wistar-Kyoto,WKY)大鼠为正常对照组,正常饲养的SHR对照组为疾病对照组,含有333mg/L TMAO饮用水的SHR为低浓度干预组、含有1g/L TMAO饮用水的SHR为高浓度干预组。2.测量大鼠的收缩压、舒张压、体重以及24小时的饮水量、排尿量和进食量。3.心脏超声检查检测大鼠的心率、心输出量、搏出量、分数缩短、射血分数、左室流出道(left ventricular outflow tract,LVOT)、主动脉根(aortic root,Ao Root)、舒张期左室前壁厚度(left ventricle anterior wall thickness in diastole,LVAWd)、收缩期左室前壁厚度(left ventricle anterior wall thickness in systole,LVAWs)和左心房尺寸(left atrial dimension,LA)等指标的变化以评估心脏功能。4.自动化学分析仪测定大鼠的血浆尿素、肌酐、钠、钾以及尿钠尿钾的水平。5.利用酶联免疫检测大鼠血浆中的血管紧张素II、抗利尿激素、醛固酮、N端前脑钠素的水平。6.利用液相色谱串联质谱检测大鼠血浆中的TMAO、神经递质及其代谢物的水平。7.采集大鼠的心脏、肾脏以及主动脉组织制作冰冻切片并对其进行Masson染色、Von kossa染色,评估大鼠脏器的纤维蓄积和钙盐沉淀等病理变化,对主动脉组织进行油红O染色评估其内膜脂肪蓄积的程度。结果:1.低浓度TMAO干预的SHR大鼠血浆中的TMAO水平显著高于SHR对照组(P<0.0001)。与低浓度TMAO干预组相比,高浓度干预组的血浆TMAO水平增加了3倍(P<0.0001)。各组之间的食物摄入量和体重差异无统计学意义。然而,与SHR对照组相比,低浓度与高浓度TMAO干预组的尿量水平均显著升高(P=0.0166和P=0.0268)。随着TMAO剂量的增加,舒张压有降低的趋势但无统计学意义(P=0.1775)。高浓度TMAO干预SHR后,其收缩压显著低于SHR对照组(P=0.0013)。2.各组的基本超声心动图参数,包括心率、心输出量、搏出量、分数缩短和射血分数,均无统计学差异。而与SHR对照组相比,高浓度TMAO干预SHR后,其部分心脏结构参数(LVOT、Ao Root、LVAWd和LVAWs)均显著下降(P=0.0365、P=0.0368、P=0.0119和P=0.0101)。而高浓度TMAO干预SHR后出现出较低的LA水平但差异无统计学意义(P=0.0563)。3.各组大鼠的血浆尿素以及肌酐等肾功能指标差异均无统计学意义。高浓度TMAO干预组中SHR大鼠血浆钠离子浓度显著降低(P=0.0113)而血浆钾离子浓度没有显著性差异。24小时尿电解质排泄结果显示高浓度TMAO干预SHR后其尿钠与尿钾的排泄量均有所增加(P=0.0086以及P=0.0481)。TMAO干预并没有导致SHR血管紧张素II分泌的改变,但可以降低SHR抗利尿激素(P=0.0012)、醛固酮(P=0.0457)的分泌,氨基端前脑钠素分泌有降低的趋势但无统计学意义(P=0.0543)。4.SHR在长期高浓度的TMAO作用下,谷氨酰胺血浆浓度显著升高(P=0.0037),而其余19种神经递质及其代谢物均无统计学差异。5.左心室心、主动脉切片以及肾脏组织病理染色检测结果显示,心肌纤维组织增生以及钙盐沉积的情况在SHR对照组中最为显著,而在高浓度TMAO干预下的SHR心肌纤维组织增生(P=0.0096)以及钙盐沉积(P=0.0024)均显著减少。而在肾脏以及主动脉的组织学切片中,各组之间的病理染色阳性面积比例均无统计学差异。结论:1.长期高浓度TMAO干预对SHR有促进钠离子排泄的利尿作用且对肾功能没有造成影响,同时可以显著降低SHR的收缩压以及改善部分心脏超声指标。这将为TMAO对血压调节的作用以及机制研究提供重要的动物实验证据。2.长期高浓度TMAO干预并没有对SHR产生不良的心血管作用。相反,TMAO减轻了SHR心肌纤维组织增生以及钙盐沉积,提示TMAO对缓解心脏纤维化起到一定的作用,这可能与其利尿作用有关。同时,主动脉亦未发现显著病理学改变,提示长期单纯补充TMAO并不影响SHR血管的纤维化、钙化或脂质沉积。第三章TMAO对自发性高血压大鼠主动脉转录组学的影响目的:通过运用多维度的生物信息学分析方法以研究SHR主动脉转录组学的变化,进一步探索TMAO对SHR血压调控以及血管病变相关的潜在机制,阐明TMAO是否会影响SHR动脉粥样硬化或炎症相关的生物学过程以及信号通路。方法:1.以第二章中大鼠分离得到的主动脉组织为研究对象,采用转录组测序对主动脉组织进行基因表达水平的检测,DESeq2工具包分析高浓度TMAO干预SHR后其主动脉的差异表达基因,cluster Profiler包进行Gene Ontology(GO)以及京都基因和基因组数据库(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes databases,KEGG)富集分析。2.构建加权基因共表达网络(weighted correlation network analysis,WGCNA)分析基因模块与TMAO干预后表型的关系。3.基于大鼠主动脉组织转录组数据的免疫微环境分析推算36种免疫细胞丰度,评估主动脉免疫细胞浸润状态。结果:1.SHR对照组与WKY对照组对比的主动脉差异基因中,619个显著上调的基因在高浓度TMAO干预后被显著下调,250个下调基因在高浓度TMAO干预后被显著上调。这些基因主要富集在胰岛素以及脂质代谢通路,其中包括甲状腺激素信号通路、胰高血糖素信号通路、调节脂肪细胞的脂解作用、甲状腺激素的合成、胰岛素抵抗、胰岛素信号通路、腺苷-3′,5′-环单磷酸信号通路、以及环磷酸鸟苷-蛋白激酶G等信号通路,但未发现显著的免疫炎症相关通路富集。2.在加权基因共表达网络中,共识别出三个关键基因模块与高浓度TMAO干预后的SHR表型特征显著相关。关键基因模块主要与脂质代谢调控以及凋亡自噬等生物学过程密切相关,包括:负调节极低密度脂蛋白粒子的重构、胆固醇转入、脂蛋白分解过程以及脂质代谢过程、蛋白质折叠、负调控凋亡过程以及细胞核自噬等,而并未发现显著的免疫炎症相关通路富集。3.与SHR对照组相比,高浓度TMAO组主动脉中的36种免疫细胞浸润丰度均无统计学差异。结论:TMAO对SHR可能具有调节胰岛素分泌以及脂质代谢的潜在作用,但上一章节中的实验结果已表明主动脉内膜脂质沉积并未受TMAO作用,提示TMAO有可能对SHR其他器官或组织的脂质代谢具有调控作用。同时转录组分析结果并未显示主动脉存在炎症细胞浸润以及免疫炎症相关信号通路的变化,提示单纯补充TMAO可能不会导致血管炎症的发生。第四章TMAO对自发性高血压大鼠内脏脂肪的作用目的:观察TMAO对SHR胰岛素分泌以及内脏脂肪组织代谢的影响,揭示TMAO干预所导致的脂肪代谢差异对高血压发病以及机体代谢的潜在影响。为研究TMAO在高血压疾病中的内脏脂肪代谢作用提供实验证据。方法:1.动物干预方式同第二章。干预后对大鼠进行口服葡萄糖耐量试验并收集分离血浆,利用全自动生化仪检测血浆甘油三酯(triglyceride,TG)和总胆固醇(cholesterol,CHO)等生化指标。2.酶联免疫检测血浆中脂肪细胞炎性相关因子IL-6,IL-1β,TNF-α,MCP-1,瘦素以及胰岛素等水平。3.收集大鼠腹腔大网膜白色脂肪组织,酶联免疫检测组织中血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)水平。并对其进行苏木精-伊红以及Masson染色,采用Image J软件分析脂肪细胞大小以及纤维组织占比。4.利用气相色谱串联质谱检测内脏脂肪组织中的40种中长链脂肪酸水平。结果:1.高浓度TMAO干预SHR后,其血浆胰岛素水平显著升高(P=0.0260)。与SHR对照组相比,TMAO干预后的SHR空腹血糖水平有轻度下降的趋势,但差异无统计学意义(P=0.2453)。口服葡萄糖耐量试验结果提示TMAO干预虽然使得胰岛素升高但糖耐受量并未有受损,且口服糖耐量试验曲线下面积有减少的趋势,但差异无统计学意义(P=0.0711)。2.高浓度TMAO干预SHR后,其血浆CHO水平并未发生显著变化,而TG水平则显著降低(P=0.0318)同时伴随IL-6血浆水平显著升高(P=0.0152)。其他脂肪细胞因子水平的差异均无统计学。此外,并未发现TMAO对内脏脂肪组织分泌AGT起作用,差异无统计学意义。3.高浓度TMAO干预后,SHR内脏脂肪细胞体积显著减小(P<0.0001)。同时,并未发现TMAO对脂肪组织胶原纤维分泌有调控作用。4.与WKY大鼠相比,SHR对照组中16种中长链脂肪酸显著降低(P<0.05),其中包括8种饱和脂肪酸(undecanoate,pentadecanoate,heptadecanoate,arachidonate,heneicosanoate,behenate,tricostate以及tetracosanoate)、2种单不饱和脂肪酸(cis-11-eicosenoic acid和cis-15-tetracosenoate)和6种多不饱和脂肪酸[linoleate,linolenate,cis-11,14,17-ricosatrienoic acid,cis-5,8,11,14,17-ricosapentaenoic acid ester,docosatetraenoate和docosapentaenoic acid(C22:5N3)]。而高浓度TMAO干预后,SHR内脏脂肪组织中单不饱和脂肪酸cis-15-tetracosenoate以及4种多不饱和脂肪酸[cis-11,14,17-ricosatrienoic acid,docosatetraenoate,docosapentaenoate n-3(C22:5N3),and docosapentaenoate n-6(C22:5N6)]均显著升高。结论:1.TMAO可以增加SHR胰岛素的分泌并有提高其糖耐量的趋势,同时TMAO可以降低SHR血浆TG水平以及减小其内脏脂肪细胞的体积。提示TMAO可能对SHR的脂代谢起积极作用。2.TMAO并未调节内脏脂肪组织AGT分泌,提示TMAO对SHR的降压作用可能与内脏脂肪组织AGT的分泌作用无关。3.TMAO可以部分改善SHR不饱和脂肪酸的代谢紊乱,这将为研究TMAO在高血压机体中的脂肪酸代谢作用提供了新的线索。第五章TMAO对脂肪组织的作用机制目的:分析内脏脂肪组织转录组学并利用细胞模型揭示TMAO调控SHR内脏脂肪细胞脂代谢的潜在分子生物学机制。方法:1.以第四章分离获得的大鼠内脏脂肪组织为研究对象,采用转录组测序对内脏脂肪组织进行基因表达水平的检测,DESeq2工具包分析高浓度TMAO干预后的差异表达基因,cluster Profiler包进行GO以及KEGG富集分析。2.构建加权基因共表达网络分析基因模块与TMAO干预后表型的关系。并对相关信号通路进行富集分析以及在KEGG通路图中映射可视化。3.以3T3-L1前脂肪细胞为研究对象,利用游离脂肪酸(棕榈酸和油酸)构建脂质蓄积细胞模型,通过CCK8以及聚合酶链反应检测TMAO干预后细胞模型的活力以及凋亡相关基因表达的变化,确定TMAO最适干预浓度。4.通过对3T3-L1前脂肪细胞进行质粒转染,过表达Pik3r3。细胞实验分组:正常培养对照组,游离脂肪酸诱导组,TMAO+游离脂肪酸诱导组,过表达Pik3r3+TMAO+游离脂肪酸诱导组。5.通过油红O染色检测各组细胞模型脂质蓄积的变化。6.蛋白免疫印迹检测各组细胞Pik3r3,Lamp1,Lamp2,Ctss,Ctsc,p-AKT(苏氨酸308和丝氨酸473位点),AKT,p-p70S6K,p70S6K以及LC3II/I蛋白表达水平。结果:1.SHR对照组与WKY大鼠对照组对比的内脏脂肪组织差异基因中,40个显著上调基因在高浓度TMAO干预后被显著下调,33个下调基因在TMAO干预后被显著上调。这些基因主要富集在吞噬作用、模式识别受体信号通路以及醛固酮合成和分泌等信号通路。2.在加权基因共表达网络中,共识别出三个关键基因模块与TMAO干预后的SHR表型特征显著相关。关键基因模块主要富集到吞噬体、溶酶体和脂肪酸代谢等相关的信号通路。对吞噬体和溶酶体相关的上游信号通路进行可视化富集分析发现,与SHR对照组相比,TMAO干预后PI3K/AKT信号通路呈现整体下调的趋势,其中PI3K的调节亚基Pik3r3显著下调(adjusted P=0.0098,log_2 fold change=-2.1689)。3.TMAO可以显著减弱由游离脂肪酸诱导的前脂肪细胞3T3-L1的脂质蓄积,油红O染色(P=0.0063)显著减弱。而TMAO的作用在过表达Pik3r3后被抵消,油红O染色(P=0.0016)强度显著增强。4.TMAO可以显著增加被游离脂肪酸诱导的3T3-L1细胞溶酶体标志物Lamp1(P=0.0032)、Lamp2(P=0.0061)和Ctss(P=0.0013)的表达,同时Pik3r3的表达被TMAO抑制(P=0.0048),而Akt苏氨酸308位点(P=0.0492)、丝氨酸473位点的磷酸化(P=0.0057)以及p70S6K(P=0.0140)的磷酸化修饰也被TMAO抑制。自噬标志物LC3II/I比值在TMAO干预后显著增加(P=0.0095)。在过表达Pik3r3后,TMAO的作用被抵消。结论:TMAO对脂肪组织代谢调控的机制与溶酶体有关。TMAO可以通过抑制PI3K调节亚基Pik3r3的表达进而抑制Akt信号通路并激活自噬溶酶体反应,最终减少由游离脂肪酸诱导的脂质蓄积。这将为阐明TMAO对脂肪代谢调控作用的潜在机制提供新的实验证据。综上所述,本研究中大规模人群临床数据和实验动物模型的结果都一致地提示了TMAO与高血压可能并无关联并且TMAO在降低收缩压方面可能具有一定的积极作用。同时本研究的动物与细胞实验还揭示了TMAO调控内脏脂肪组织脂质代谢的积极作用以及其中可能的分子调控机制。本研究为阐明TMAO对高血压机体心血管以及脂代谢调控作用的潜在机制提供了新的证据,同时将为加深TMAO对高血压以及内脏脂肪代谢之间复杂调控网络的认识提供重要的科学依据,有望丰富TMAO对心血管代谢性疾病作用的机制学说,为今后疾病预警或靶向治疗提供新的思路。

【学位授予单位】：华南理工大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2023

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