科研

导读  

在极端环境条件下，食物的选择和摄入对哺乳动物的生存和健康存在影响。研究认为，食物成份是肠道微生物群变化的关键驱动因素；然而，在极端自然条件下，肠道微生物群如何对季节性食物变化作出反应，目前仍知之甚少。采用植物trnL（UAA）和16S rRNA测序，对青藏高原自由放牧牦牛的食物组成和肠道细菌群落组成进行了研究。结果表明，冬季的食物组成比夏季更为多样化，而Gramineae和Rosaceae则被全年频繁食用；食物的季节性变化和肠道菌群组成变化一致。牦牛为了更好地利用氮和能量，根据食物在温暖和寒冷季节之间的变化而改变肠道类型，特别是在严寒季节。我们的发现为理解哺乳动物适应高海拔环境的食物-微生物相互作用的季节性变化提供了见解。

论文ID

原名：Seasonal dynamics of diet–gut microbiota interaction in adaptation of yaks to life at high altitude

译名：牦牛适应高海拔生活过程中，食物-肠道微生物相互作用的季节变化

期刊：npj Biofilms and Microbiomes

IF：7.067

发表时间：2021.04.20

通讯作者： 尚占环；张志刚；龙瑞军

通讯作者单位： 兰州大学草原农业生态系统国家重点实验室生命科学学院；云南大学生命科学学院云南省生物资源保护与利用国家重点实验室；中国科学院昆明动物研究所进化与功能基因组学实验室遗传资源与进化国家重点实验室

实验设计

本研究中，收集分别位于OCG和TH区域（图S1）的牦牛粪便样本进行分析。OCG区域的牦牛为自由放牧，TH区域的牦牛于牧场放牧。两处放牧区域的放牧地点、海拔、年均气温及植物（食物）种类存在区别。两处牧区草地类型为高寒草甸和高寒灌丛草甸，植物生长季为90~120天。根据前人的研究，试验区的温度和降水等信息由附近的气象站采集。四季划分为：4~5月春季，6~8月夏季，9~10月秋季，11~次年3月冬季（图S2）。本研究中，采样时间为2017年，分别为春季（5月），夏季（8月），秋季（10月），冬季（12月）（粪便样品数目：对于TH区域：春季n=32；夏季n=33；秋季n=37；冬季 n=4 5 ，对于OCG：春季n=31；夏季 n=39；秋季n=38；冬季 n=47）。所有样品采集后用液氮保存，运回兰州大学进行DNA提取及后续处理分析。  在TH和OCG区域，随机选取三个100×100 m的样方，每个样方内选取5个50×50 cm的样点，收集地上生物量（AGB），在65℃烘干至恒重，研磨过1mm 筛，用于后续化学分析。通过105℃烘干测定干物质重（DM），通过乙醚提取EE，凯式氮法测定N含量，根据Van Soest等人的研究测定NDF和ADF。通过叶绿体trnl DNA测序对植物进行DNA宏条形码分析。通过16S rRNA基因测序分析样品的微生物群落。测序结果通过QIIME 1.9.1平台进行处理。  为了从粪便样本中鉴定饮食植物序列，研究者还建立了一个广泛的DNA参考数据库，该数据库来自整个研究的高山草原地区，永丰滩和乌鞘岭的植物物种。收集了212种在研究区域最丰富的物种。所有的植物都被植物学家鉴定到种水平。  通过R语言对微生物群落在属水平的相对丰度进行了聚类分析，以鉴定牦牛肠道肠型。此外，利用R语言通过Wilcoxon test、Wilcoxon test、t-test等统计分析方法，对试验数据进行了统计分析。  

结果

1 建立DNA宏条形码分析参考数据库根据国家生物技术信息中心（NCBI）和Bold系统数据库，研究区有199种植物。结合植物分类学鉴定，利用叶绿体trnL (UAA)内含子标记基因的P6 区，生成额外的包含212种本地植物的DNA条形码参考库。这一数据库被用于DNA宏条形码分析。总的来说，该数据库共包含411种植物(包括采样区域的所有物种及当地植物名录记载的386个物种)，分布在以TH和OCG方式放牧的整个高山草原研究区域。 2 不同季节的食物多样性及组成食物（植物）数据包括30534414个高质量序列、81530个去除单子后的独特序列和2010个OTUs（表S3）。所有食物序列包含41个科，83个属和80种。在两种放牧方式下，冬季的食物组成比夏季更为多样化，并且表现出明显的季节差异性（图1a、b和图S4、S5b, e）。在TH和OCG，牦牛全年频繁食用Gramineae和Rosaceae植物（图2a，c）。在TH和OCG，春季和夏季相对丰度最高的是Polygonaceae，Rosaceae以及Gramineae，冬季相对丰度最高的是Gramineae, Rosaceae以及Compositae。秋季，Gramineae和Rosaceae丰度在TH和OCG牧最高，Salicaceae在TH也较高。作为指示植物物种，于春季识别出了Polygonaceae，于冬季在TH和OCG识别出了Scrophulariaceae和 Compositae，于夏季在TH识别出了Polygonaceae、在OCG识别出了Rosaceae，于秋季在TH识别出了Salicaceae、在OCG识别出了Gramineae (图2b, d；图S7a, b)。不同季节食物组成的显著差异为研究食物组成的季节差异对牦牛肠道微生物的影响提供了依据。 图1 不同放牧方式下牦牛食物和肠道微生物群落结构的季节变化。季节内和季节间，饮食和微生物群落的Bray–Curtis差异性见表S2。行显示相同的饮食(a和b)和微生物群(c和d)组成排序。饮食组成和肠道微生物群代表了季节性迁移放牧（a和c）和自由放牧（b和d）方式。从样品中分析的牦牛个体食物组成分析：（a）表示在季节性迁移放牧区域的食物组成，春（n=32）、夏（n=33）、秋（n=37）和冬（n=45）（anosim分析：R=0.94，p=0.0001；adonis分析：R2=0.78，p=0.0001；（b）表示在自由放牧区域的食物组成，春季（n=31），夏季（n=39），秋季（n=38），冬季（n=47）（anosim分析：R=0.88，p=0.0001；adonis分析：R2=0.67，p<0.0001），（c）表示在季节性迁移放牧区域的肠道菌群组成，春季（n=31）、夏季（n=31）、秋季（n=37）和冬季（n=48）的肠道菌群组成（anosim分析：R=0.50，p<0.0001；adonis分析：R2=0.16，p<0.0001），（d）表示在自由放牧区域的肠道菌群组成，春季（n=31）、夏季（n=37）、秋季（n=38）、冬季（n=47）（方差分析：R=0.47，p<0.0001；adonis分析：R2=0.16，p<0.0001），图基于Bray-Curtis不相似性绘制在非计量多维标度（NMDS）上。相似性分析（ANOSIM）、adonis分析和PERMANOVA分析用于相似性处理的统计检验。虚线椭圆边框表示95%的置信区间。
图2 季节性迁移放牧和自由放牧条件下牦牛食物组成的季节变化。Stream图显示了春季、夏季、秋季和冬季在季节性迁移放牧（a）和自由放牧（c）条件下植物科水平类群的相对丰度。低丰度类群（<5%）被归为“其他类群”。在季节性迁移放牧（b）和自由放牧（d）区域，使用Sankey图跟踪与每个季节相关的指示科。线条表示指示植物科和季节之间的关联，它们由植物科着色。线宽按比例缩放以反映指标值（族的指标值越高，与季节的关联越强）。指示值如图S7所示。统计p值表示与季节相关的家系, *p<0.05,**p<0.01, ***p<0.001。 在OCG，温暖季节（6~9月）地上生物量（AGB）最高，9月份为2891±148 kg DM/ha，在寒冷季节（10月~5月）最低，5月份为99±10.8 kg DM/ha（图3a）。中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）在寒冷季节分别比温暖季节高出10%和16%，而粗蛋白（CP）和乙醚提取物（EE）分别比温暖季节低53%和25%（图3b）。具体来说，最高CP（166± 10.2 g/kg DM）出现在6月份，最低（39± 5.5 g/kg DM）出现在4月份。在TH区也观察到类似的趋势（图S3a, b）。因此，牦牛在寒冷季节不得不面临低氮的食物。图3 自由放牧草地全年地上生物量（AGB）和食物化学组成（基于干物质）的季节变化。折线图a表示AGB（kg DM/ha）。虚线是全年平均AGB。折线图b表示全年食物的化学成分（粗蛋白（CP）、乙醚提取物（EE）、酸性洗涤纤维（NDF）和中性洗涤纤维（ADF））。虚线是全年各化学成分的平均值，并由各化学成分着色。数值和误差线显示为平均值±标准差。CP平均含量与NDF（c）（R2=0.59，p<0.001）和ADF（d）（R2=0.78，p<0.001）呈负相关。统计检验采用FDR（错误发现率）校正p值的t-test，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。 3 不同季节肠道菌群的多样性及组成

肠道微生物群落包括25375771个高质量序列、1125235个去除单子后的独特序列和14239个OTUs（表S3）。在TH和OCG，肠道微生物群落的季节变化都很明显（图1c，d）。共识别出18个肠道菌门，在各季节和各放牧方式下，Firmicutes和Bacteroidetes都最为丰富，（图S6、图S7c、d）。在TH和OCG，肠道菌群属水平上表现出明显的季节动态，其中Ruminococcaceae_UCG-010, Ruminococcaceae_UCG-005,Rikenellaceae_RC9_gut_group, unclassified Ruminococcaceae 及 unclassifiedBacteroidales在各季节都最为丰富（图4a，c）。此外，Prevotellaceae_UCG-004的相对丰度在夏季有所增加。属水平的指示物种表现出了时空差异性。在TH，春、秋、冬季的指示种为Ruminococcaceae_UCG-010和Clostridiales_vadinBB60_group；夏季为Ruminococcaceae_UCG-005和Prevotellaceae_UCG-004。在OCG，春、夏两季的指示种分别为Ruminococcaceae_UCG-010和 Clostridiales_vadinBB60_group；秋季分别为Flavonifractor, Ruminococcaceae_UCG-005和Prevotellaceae_UCG-004；然而，在冬季是unclassified Paludibacteraceae（图4b，d；图S7e，f）。

 图4 不同放牧方式下牦牛肠道菌群在属水平上的季节变化。（a）季节性迁移放牧和（c）自由放牧条件下，以染色Stream图表示的20个最丰富的属在四季（春、夏、秋和冬）的相对丰度。低丰度类群（除20个最丰富的属外）被归为“其他”类群。在季节性迁移放牧（b）和自由放牧（d）条件下，使用Sankey图跟踪与每个季节相关的指示属。线表示指示属和季节之间的关联，这些关联按属级别着色。线宽被缩放以反映指示值（属的指示值越高，与季节的关联越强）。指标值如图S7所示。统计p值表示与季节相关的属, *p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
 4 饮食与各季节微生物群落组成有关我们应用Procrustes分析来测试不同季节饮食和微生物群的变化。当使用Bray–Curtis（BC）差异分析时，饮食组成的季节性变化与TH（p=0.0001，图5a）和OCG（p=0.0001，图5b）的微生物群落组成变化一致。然而，微生物群落丰富度与饮食丰富无关（图S8）。 图5 不同放牧方式下，牦牛食物-微生物相互作用的季节性聚类模式。（a）季节性迁移放牧和（b）自由放牧条件下，饮食和微生物群组成由Bray–Curtis距离决定，按季节着色。Procrustes旋转食物组成（圆形符号）和肠道微生物组成（三角形符号）的独立主坐标的结果。p值显示食物和微生物群之间差异显著。
 不同季节之间的饮食和微生物群差异始终高于不同季节（图6和表S2）。四季间的食物组成差异最小的是，TH春、夏季之间（0.482）以及OCG的秋、冬季之间（0.566）；最大的是，TH的夏、冬季（0.779）之间以及OCG的春、秋季（0.734），表明植物是否可以获得决定了食物的消耗（表S2）。在TH和OCG中，大多数重叠微生物群落出现在秋季和冬季之间，而大多数非重叠微生物群落出现在春季和夏季之间，这表明微生物群保持相对稳定（表S2）。在季节内，两种放牧制度下，食物组成差异（0.117–0.385）比微生物群落组成差异（0.432–0.486）更大，表明稳定的肠道微生物群落可能有助于宿主适应极端环境（图6；表S2）。 图6 不同放牧方式下，季节间食物多样性和肠道微生物多样性的Bray–Curtis不相似性分析。行显示了不同季节食物组成（a和b）和肠道微生物群落（c和d）的差异。每一列对数据进行组织，以便食物组成和肠道微生物群落组成的Bray-Curtis不相似性代表了季节性迁移放牧（a和c）和自由放牧（b和d）。所有boxplot分布均采用非参数Kruskal–Wallis和Wilcoxon进行分析，并用FDR（错误发现率）修正p值，中心值表示中间值和误差栏， *p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
 5 以Akkermansia和uncultured Eubacterium WCHB1-41为代表的潜在的冷适应性肠道类型和功能背景基于肠型能够反应出功能性差异的报道，我们研究了牦牛肠道微生物群落是否能够根据季节性饮食差异划分为功能性不同的群。主成分分析（PCA）显示样本基于BC差异分析形成了三个不同的肠型。每个肠型由其代表性菌属的变化驱动：肠型1为Akkermansia和 uncultured Eubacterium WCHB1-41，肠型2为Ruminococcaceae_UCG-005，肠型3为Ruminococcaceae_UCG-010（图7a，d-g；图S9, 10）。在TH和OCG中，不同季节的肠型有变化。肠型1主要出现在寒冷季节（春季、秋季和冬季），肠型2主要出现在温暖季节（夏季）（图7b、c；p<0.05，Fisher’s exact test）和肠型3在全年都出现（图7b，c）。本研究识别了了高原牦牛不同肠型的季节分布。 图7 使用Bray-Curtis不相似性分析与季节有关的牦牛肠道菌群的肠型分布。牦牛肠型的鉴定见图S9。（a）肠型的可视化，以PAM聚类所确定。每个肠型对应的属是通过它们的相对丰度来确定的（见图S10）。（b）和（c）分别表示春季、夏季、秋季和冬季季节性迁移放牧和自由放牧条件下各肠型的样本比例。（d）~（g）每种肠型细菌分类群的相对丰度。根据它们对整体Bray–Curtis不相似性的平均贡献，选择了10个属。所有六个细菌属展示在图S10中。颜色对应于肠型簇。所有条带分布均采用Fisher精确检验和FDR（错误发现率）修正的双尾p值（b和c）进行检验。用非参数Kruskal–Wallis和Wilcoxon检验所有箱线图分布，用FDR校正p值，中心值表示中间值和误差线（d~g），*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
这些肠道肠型的季节性分布使我们推测，以Akkermansia和 uncultured Eubacterium WCHB1-41为代表的固定肠道肠型，在食物稀少的寒冷季节对调节营养需求起着至关重要的作用。为了验证这一假设，我们在KEGG数据库中基于属水平泛基因组研究了Akkermansia和Kiritimatellaeota的关联功能。结果表明，Akkermansia和Kiritimatiellaeota表现出酶（参与精氨酸和脂肪酸生物合成途径）的趋同富集（map00220和map00061）（图8）。由Akkermansia和 Kiritimatiellaeota介导的丙酮酸，产生乙酰辅酶A，进入三羧酸（TCA）循环，参与精氨酸的生物合成，也调节脂肪酸的合成。值得注意的是，我们观察到12种酶在精氨酸生物合成中起关键作用，但在低氮胁迫条件下，没有酶参与尿素合成以减少尿中氮的损失。7种酶中有6种直接参与脂肪酸的生物合成，并有助于能量沉积。这些结果表明，高海拔哺乳动物为了在寒冷季节有效利用氮和能量沉积而进化出脂肪酸的生物合成途径。 图8 宿主与Akkermansis和uncultured Eubacterium WCHB1-41_ge相关的代谢途径。Akkermansis和uncultured Eubacterium WCHB1-41_ge的组成是影响精氨酸和脂肪酸合成的关键因素，在寒冷季节显著升高。这些微生物群可能有助于在饮食和蛋白质摄入不足的寒冷季节产生能量。所有酶和EC（酶命名法）编号均来自KEGG数据库。
 

讨论

我们测定了高海拔地区大型食草动物饮食组成和肠道微生物群落组成的季节变化。牦牛常年在青藏高原的草原上放牧，面临着严峻的挑战，特别是在极寒、食物供应有限的季节。为了在这样的条件下生存，牦牛进化出了解剖学和生理学上的适应能力。此外，本研究还报道了牦牛及其瘤胃微生物群落的趋同进化。瘤胃微生物群落遵循独特的适应策略，其组成与低海拔地区的反刍动物不同。在这项研究中，季节对饮食和肠道微生物群落都有限制，但对微生物群落的限制不如饮食。季节对微生物群落组成的影响与食物供应和化学组成有关，可能是源于底物可利用性导致的肠道微生物群落结构的重新装配。令人惊讶的是，在不同季节，与饮食组成的变化相比，肠道菌群是相对稳定的，这表明高海拔哺乳动物的肠道菌群组成在不同季节间进化出了稳定的模式。相比之下，人类和其他哺乳动物的肠道微生物群随着季节性饮食变化而显著不同。为了应对宿主的周期季节性饮食波动，肠道微生物群可以改变其代谢率和从复杂碳水化合物中提取的能量，并最终促进宿主和微生物的共同进化。此外，我们的研究结果支持了目前的TH区域的放牧策略，即将牦牛迁移到不同的地点、寻找合适的食物。这种做法减轻放牧压力，从而提高动物的性能。正如我们的饮食和微生物群落分析所表明的那样，对于牦牛和植物之间的关系有更好的理解，可以为TH区域适当的放牧率和改善草地管理策略提供良好见解。与进食效率相关的关键微生物群可为加强以微生物群落为主导的饲养计划提供替代解决方案，以改善牦牛的生长性能，特别是在寒冷季节。缺乏准确的方法来评估和识别放牧草食性哺乳动物的复杂饮食特点一直是野外研究的一个长期障碍。常规方法包括野外观察、显微组织学和植物表皮蜡中天然正构烷烃的提取。但是，这些方法不适合于植物多样性较高的草食性哺乳动物的饮食分析。现场观察要求高能见度，容易遗漏植物物种，而组织学非常繁琐，而且往往不准确。当动物消耗大量植物物种时，正烷烃法识别能力有限。用正构烷烃法测定青藏高原放牧牦牛的食物组成时，只能检测出2、3种主要膳食成分。DNA宏条形码研究从冻土沉积物样品中鉴定出了大型土壤动物饮食以非禾本草本占优势，并能够从7种大型食草哺乳动物中分离出细粒度生态位。这些研究表明，利用DNA宏条形码可有效地定性和定量识别摄入的植物。

本研究提供了对肠道菌群和功能的生物学见解。特别的，我们描述了自由放牧牦牛肠道类型以及功能基因组信息随季节饮食的变化。Ruminococcaceae_UCG-005肠型在温暖季节与高蛋白低纤维饮食相关，而Akkermansia和uncultured EubacteriumWCHB1-41肠型在寒冷季节与低蛋白高纤维饮食相关。这表明，饮食中蛋白质和碳水化合物含量的比例介导了宿主的肠型转变，至少在狒狒体内是这样的。饮食蛋白质和碳水化合物含量的季节性变化可以为肠型动力学提供一个有吸引力的解释，也有助于确定高海拔食草动物的肠型。研究表明，在进行为期10天的低脂/高纤维饮食干预后，人类肠道的肠型保持稳定。然而，本研究中，关于肠型季节性饮食变化的最令人信服的证据是，肠型1和2在季节之间持续变化，而Ruminococcaceae_UCG-01肠型3全年保持稳定。这可能是宿主与环境长期共同进化的结果，说明固定的季节性肠型动态在哺乳动物物种形成和适应高海拔极端环境中起着关键作用。

Akkermansia存在于肠道粘液层，以其对粘液蛋白的降解而闻名。据报道A. muciniphila在预防肥胖症、1型和2型糖尿病方面起着关键作用，因此促进人类健康。此外，有证据表明，A. muciniphila可作为一种能量传感器，调节宿主微生物相互作用的能量稳态。本研究表明，在寒冷季节低氮低能量摄入的Akkermansia和uncultured Eubacterium WCHB1-41肠型1显著增加，表明该肠型对高纤维低蛋白质饮食有响应。先前的研究表明，高脂肪饮食减少黏液厚度，而富含纤维的饮食增加黏液厚度，从而改善肠道正性屏障功能。Akkermansia和uncultured Eubacterium WCHB1-41降解粘蛋白并将其转化为短链脂肪酸(SCFAs)，为其他细菌和细胞提供营养。

牦牛的遗传研究表明，氨基酸代谢基因（Whsc1，Glul）、脂肪酸生物合成和代谢基因（Hsd17b12）以及36个与高海拔反刍动物瘤胃上皮中挥发性脂肪酸转运和吸收相关的基因表达上调。这些研究为牦牛对能量摄入不足提供了额外适应性反应。此外，据报道，在寒冷的季节，牦牛对氮的需求相对较低，并且比黄牛能够更有效地利用食物中的氮。目前的研究还提供了一种机制解释，因为Akkermansia和Kiritimatiellaeota参与精氨酸和脂肪酸的生物合成途径，从而在寒冷季节利用食物中的氮，并产生能量。在代谢性疾病患病率增加的背景下，本研究提供了Akkermansia和uncultured EubacteriumWCHB1-41肠型对宿主氮和能量利用的影响的见解，表明该肠型在高原动物的营养稳态中起着关键作用，对人类代谢性疾病治疗具有很大的潜力。进一步分析牦牛肠道微生物群的基因组功能将有助于更好地了解生活在极端环境中的哺乳动物。本研究结果表明，牦牛肠道菌群对季节性饮食变化存在响应，这使得牦牛能够更好地利用低蛋白质含量的低质食物。对饮食-肠道微生物群相互作用的理解提高了我们对牦牛如何适应极端环境的理解。

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